د مالیکولر تشخیص، په عام ډول د PCR ټیکنالوژي او اصول کارول کیږي

PCR، د پولیمیریز سلسله عکس العمل دی ، کوم چې د DNA پولیمیریز کتلیزیز لاندې سیسټم ته د dNTP ، Mg2+ ، اوږدوالي فکتورونو او د لوړولو فکتورونو اضافه کولو ته اشاره کوي ، د اصلي DNA د ټیمپلیټ په توګه او ځانګړي پریمرونه د تمدید د پیل ټکي په توګه کاروي ، د denaturation، annealing، extension، etc. د مرحلې له لارې، د ویټرو د نقل کولو لور سټرنډ DNA د والدین سټینډ ټیمپلیټ DNA بشپړولو پروسه په چټکۍ او په ځانګړې توګه په ویټرو کې هر هدف DNA ته وده ورکولی شي.

1. ګرم پیل PCR

په دودیز PCR کې د امپلیفیکیشن پیل وخت د PCR ماشین کې د PCR ماشین کې اچول نه دی ، او بیا برنامه پراخه کول پیل کوي.کله چې د سیسټم ترتیب بشپړ شي، امپلیفیکیشن پیل کیږي، کوم چې کیدای شي د غیر مشخص پراخوالي لامل شي، او د ګرم پیل PCR کولی شي دا ستونزه حل کړي.

ګرم پیل PCR څه شی دی؟وروسته له دې چې د عکس العمل سیسټم چمتو شي، د انزایم موډیفیر په لوړه تودوخه کې خوشې کیږي (معمولا د 90 ° C څخه لوړ) د عکس العمل لومړني تودوخې مرحله یا "ګرم پیل" مرحله کې، ترڅو د DNA پولیمیریز فعال شي.د فعالولو دقیق وخت او تودوخه د DNA پولیمیریز په ماهیت او د هاټ سټارټ ترمیم کونکي پورې اړه لري.دا طریقه په عمده توګه د DNA پولیمیریز فعالیت منع کولو لپاره د ترمیم کونکي لکه انټي باډیز، affinity ligands، یا کیمیاوي ترمیم کونکي کاروي.څرنګه چې د DNA پولیمیریز فعالیت د خونې په حرارت کې منع کیږي، د ګرم پیل ټیکنالوژي د PCR تعاملاتو ځانګړتیا قرباني کولو پرته د خونې په حرارت کې د ډیری PCR عکس العمل سیسټمونو چمتو کولو لپاره عالي اسانتیا چمتو کوي.

2. RT-PCR

RT-PCR (ریورس ټرانسکرپشن PCR) د mRNA څخه cDNA ته د بیرته راګرځولو او د امپلیفیکیشن لپاره د ټیمپلیټ په توګه د کارولو لپاره تجربه لرونکی تخنیک دی.تجرباتي کړنلاره دا ده چې لومړی په نسجونو یا حجرو کې ټول RNA استخراج کړئ، د پریمر په توګه Oligo (dT) وکاروئ، د cDNA ترکیب کولو لپاره ریورس ټرانسکریټس وکاروئ، او بیا د هدف جین ترلاسه کولو یا د جین څرګندولو کشف کولو لپاره د PCR امپلیفیکیشن لپاره د ټیمپلیټ په توګه cDNA وکاروئ.

3. د فلوروسینټ مقداری PCR

د فلوروسینټ مقداري PCR (ریښتیني وخت مقداري PCR ،RT-qPCR) د PCR عکس العمل سیسټم ته د فلوروسینټ ګروپونو اضافه کولو میتود ته اشاره کوي ، د فلوروسینټ سیګنالونو راټولول په ریښتیني وخت کې د PCR ټولې پروسې نظارت کولو لپاره ، او په نهایت کې د معیاري وکر په کارولو سره د ټیمپلیټ مقدار تحلیل کولو لپاره.په عام ډول کارول شوي qPCR میتودونو کې SYBR شنه I او TaqMan شامل دي.

4. Nested PCR

Nested PCR د PCR امپلیفیکیشن دوه پړاوونو لپاره د PCR پرائمرونو دوه سیټونو کارولو ته اشاره کوي، او د دویم پړاو امپلیفیکیشن محصول د هدف جین ټوټه ده.

که د پرائمرونو د لومړۍ جوړې (بهرني پرائمرونو) بې اتفاقي د دې لامل شي چې غیر مشخص محصول پراخ شي، د ورته غیر مشخصې سیمې احتمال د دویمې جوړې پرائمر لخوا پیژندل شوی او پراخیدو ته دوام ورکول خورا لږ دي. د پرائمرونو د دویمې جوړې لخوا پراخول، د PCR ځانګړتیا ښه شوې.د PCR دوه پړاوونو ترسره کولو یوه ګټه دا ده چې دا د محدود پیل شوي DNA څخه کافي محصول پراخه کولو کې مرسته کوي.

5. ټچ ډاون PCR

ټچ ډاون PCR د PCR دورې پیرامیټرو تنظیم کولو سره د PCR عکس العمل ځانګړتیا ته وده ورکولو میتود دی.

په ټچ ډاون PCR کې ، د لومړیو څو دورو لپاره د انیل کولو تودوخه د پریمرونو اعظمي انیل کولو تودوخې (Tm) څخه څو درجې پورته ټاکل شوې.د انیل کولو لوړه تودوخه کولی شي په مؤثره توګه غیر مشخص امپلیفیکیشن کم کړي ، مګر په ورته وخت کې ، د انیل کولو لوړه تودوخه به د پریمرونو او هدف ترتیبونو جلا کیدو ته وده ورکړي ، چې په پایله کې د PCR حاصل کمیږي.له همدې امله، په لومړیو څو دورو کې، د انیل کولو تودوخه معمولا په سیسټم کې د هدف جین مینځپانګې د زیاتوالي لپاره په هر دور کې د 1 ° C کمولو لپاره ټاکل کیږي.کله چې د انیل کولو تودوخې مطلوب تودوخې ته راټیټ شي، د انیل کولو تودوخه د پاتې دورو لپاره ساتل کیږي.

6. مستقیم PCR

مستقیم PCR د نیوکلیک اسید جلا کولو او پاکولو اړتیا پرته د نمونې څخه مستقیم د هدف DNA پراخولو ته اشاره کوي.

مستقیم PCR دوه ډوله دي:

مستقیم میتود: لږ مقدار نمونه واخلئ او د PCR پیژندنې لپاره مستقیم د PCR ماسټر مکس کې اضافه کړئ؛

د کریک کولو طریقه: د نمونې نمونې کولو وروسته، په لیزیټ کې اضافه کړئ، د جینوم خوشې کولو لپاره لیز، لږ مقدار لیزډ سپرناټینټ واخلئ او د PCR ماسټر مکس کې یې اضافه کړئ، د PCR پیژندنه ترسره کړئ.دا طریقه د تجربوي کاري جریان ساده کوي، په لاس کې وخت کموي، او د پاکولو مرحلو په جریان کې د DNA ضایع کیدو څخه مخنیوی کوي.

7. SOE PCR

د اوورلیپ ایکسټینشن PCR (SOE PCR) لخوا د جین جلا کول د تکمیلي پایونو سره پرائمرونه کاروي ترڅو د PCR محصولات اوورلیپنګ زنځیرونه رامینځته کړي ، ترڅو په راتلونکي امپلیفیکیشن عکس العمل کې ، د اوورلیپ کولو زنځیرونو د تمدید له لارې ، د مختلف سرچینو تخنیک چې په هغه کې پراخه شوي ټوټې یوځای کیږي. او په ګډه ویشل شوی.دا ټیکنالوژي اوس مهال دوه اصلي غوښتنلیک لارښوونې لري: د فیوژن جینونو جوړول؛د جین سایټ لخوا لارښود بدلون.

8. IPCR

Inverse PCR (IPCR) د دوه پرائمرونو پرته د DNA ټوټې پراخولو لپاره ریورس بشپړونکي پرائمرونه کاروي، او د پیژندل شوي DNA ټوټې په دواړو خواوو کې نامعلوم ترتیبونه پراخوي.

IPCR په اصل کې د نږدې نامعلومو سیمو د سلسلې ټاکلو لپاره ډیزاین شوی و، او تر ډیره د جین پروموټر ترتیبونو مطالعې لپاره کارول کیږي؛آنکوجینک کروموزوم بیا تنظیم کول، لکه د جین فیوژن، لیږد او لیږد؛او د ویروس جین ادغام هم اوس په عام ډول کارول کیږي د سایټ لخوا لارښود شوي میوټاجینیزس لپاره ، د مطلوب بدلون سره پلازمیډ کاپي کړئ.

9. dPCR

ډیجیټل PCR (dPCR) د نیوکلیک اسید مالیکولونو مطلق مقدار کولو تخنیک دی.

اوس مهال د نیوکلیک اسید مالیکولونو اندازه کولو لپاره درې میتودونه شتون لري.فوتومیټری د نیوکلیک اسید مالیکولونو د جذب پر بنسټ والړ دی.د ریښتیني وخت فلوروسینټ مقداري PCR (ریښتیني وخت PCR) د Ct ارزښت پراساس دی ، او د Ct ارزښت د فلوروسینټ ارزښت سره مطابقت لرونکي دوره شمیرې ته اشاره کوي چې کشف کیدی شي؛ډیجیټل PCR د واحد مالیکول PCR میتود پراساس د نیوکلیک اسید مقدار شمیرلو لپاره وروستۍ کمیتي ټیکنالوژي ده چې یو مطلق مقداري میتود دی.